G2P-SOL項目是一個歐盟資助的茄科作物項目，匯集了歐洲和國際上主要的種質(zhì)庫，其中包括馬鈴薯、番茄、胡椒和茄子這四種主要茄科作物的種質(zhì)資源。在該項目中，已對包括野生近緣種在內(nèi)的約 5,900 個茄子種質(zhì)進行了收集。 為了獲得約 3,500 個代表性種質(zhì)的基因組信息，該項目設(shè)計了一組定制的 5K SNP位點的SPET 技術(shù)探針（單引物富集技術(shù)，Nugen），這些SNP位點均勻分布在整個基因組，并且SNP位點主要位于基因豐富的區(qū)域。 DNA 樣本由基因庫提供，而文庫制備和 illumina 高通量基因測序由 IGA Technology 公司提供服務(wù)。測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量過濾后，使用 BWA-MEM 將reads與茄子參考基因組序列（4.1 版）比對，并使用 GATK-4.1.9軟件進行 SNP 分析。通過刪除具有低覆蓋測序數(shù)據(jù)的種質(zhì)，保留了 3,412 個，并通過應(yīng)用嚴格的質(zhì)量標準確定了 120K 多態(tài)位點。其中，4306個多態(tài)位點為5K SPET探針組靶向的SNP，其余為輔助脫靶SNP。 這些確認的SNP位點為為識別錯誤標記的種質(zhì)（即錯誤的物種識別）和基因庫內(nèi)及不同基因庫之間的重復(fù)的物種記錄提供了重要信息。此外，SPET技術(shù)可用于建立篩選實驗流程以避免不同地域進行重復(fù)的種質(zhì)資源保護。 研究茄子種質(zhì)間的種群結(jié)構(gòu)和遺傳關(guān)系可為全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome wide association study，GWAS）建立核心種質(zhì)庫。此外，基于基因庫中可用的歷史表型數(shù)據(jù)，可確定與關(guān)鍵性狀相關(guān)的位點。 實驗結(jié)果表明，SPET 技術(shù)可作為簡化基因組測序和基因芯片的替代方法，是一種可適用于高通量基因分型、管理和增強基因庫收藏的有效工具。
SPET 技術(shù)背景介紹：
單核苷酸多態(tài)性 (SNP) 是真核生物基因組中豐富的序列變異類型，并且已成為廣泛使用的基因分型標記。 基因分型方法依賴于不同的技術(shù)，包括高通量測序NGS、基因芯片和聚合酶鏈式反應(yīng) (PCR)。目前，常用的高通量 SNP 發(fā)現(xiàn)和基因分型方法是基于簡化基因組測序 (RRS)手段的高通量基因分型測序(GBS，Genotyping by Sequencing)方法，其中大多數(shù)是基于限制性內(nèi)切酶的使用來片段化基因組，通過對這些酶切DNA序列來測序來替代全基因組測序，從而達到基因分型目的。 GBS技術(shù)的一個主要限制是限制酶位點并不是在基因組上隨機分布的，因此無法在基因內(nèi)靶向定位或定位在具有功能意義的分子標記。
Nugen公司（現(xiàn)Tecan Genomics公司）開發(fā)了單引物富集技術(shù)，這是一種可定制的靶向測序的解決方案，且經(jīng)濟實惠。 SPET技術(shù)通過已有的參考基因組或轉(zhuǎn)錄組信息以及需要驗證的靶向SNP組來進行探針設(shè)計。 SPET 探針長約 40bp，探針設(shè)計為與包含SNP的相鄰DNA序列，因此能夠檢測目標SNP并發(fā)現(xiàn)目標周圍其他的SNP。SPET最初是應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，多篇Nature文獻都有報道。由于單引物富集相對于PCR引物設(shè)計具有更高的靈活性，2019年Scaglione等人在歐盟的項目中把該技術(shù)應(yīng)用在植物分子育種的研究中，評估了SPET技術(shù)對玉米和黑楊的基因分型應(yīng)用。SPET同樣可應(yīng)用于種質(zhì)集的基因分型。外顯子的保守序列應(yīng)有助于在這些區(qū)域上設(shè)計的 SPET 探針來研究不同相關(guān)物種之間的雜交，從而提高發(fā)現(xiàn)新 SNP 的機會，特別是如果探針下游區(qū)域位于保守性較低的區(qū)域，如內(nèi)含子和非翻譯區(qū)域 UTR。
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